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分光光度法測定葉綠素含量的原則

時(shí)間:2023-02-01 15:50:17   訪客:2128

原則葉綠素廣泛存在于水果、蔬菜等綠色植物組織中,在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合形成葉綠體。植物細(xì)胞死亡時(shí),葉綠素是游離的,游離的葉綠素很不穩(wěn)定,對光熱敏感;在酸性條件下,葉綠素產(chǎn)生綠褐色的脫鎂葉綠素,脫鎂葉綠素在稀酸堿液中水解成亮綠色的葉綠素以及葉綠醇和甲醇。高等植物中的葉綠素有兩種:葉綠素a和b,均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
葉綠素含量的測定方法很多,主要有:
1、原子吸收光譜法:通過測定鎂的含量,進(jìn)而間接計(jì)算出葉綠素的含量。
2、分光光度法:用分光光度計(jì)測定葉綠素提取物在最大吸收波長處的吸光度值,利用朗伯-比爾定律計(jì)算提取物中各色素的含量。
葉綠素a和葉綠素b在645nm和663nm處有最大吸收,兩條吸收曲線在652nm處相交。因此,測定提取物在645nm、663nm、652nm波長處的吸光度,根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量。
材料和儀器
植物材料96%乙醇丙酮石英砂碳酸鈣粉分光光度計(jì)電子頂載天平砂漿棕色容量瓶定量濾紙吸水紙擦拭紙滴管漏斗
步驟
1、取新鮮植物葉子(或其他綠色組織)或干燥材料,擦去組織表面的污垢,去除中脈,切塊。稱取剛切碎的樣品2g,放入研缽中,加入少量石英砂、碳酸鈣粉和3mL95%乙醇,研磨成均質(zhì)漿液,加入10mL乙醇,繼續(xù)研磨直到組織變白。靜置 3-5 分鐘。
2、取一張濾紙置于漏斗中,用乙醇潤濕,將提取物沿玻璃棒倒入漏斗中,濾液流入100mL棕色容量瓶中;用少量乙醇沖洗研缽和研杵及殘?jiān)鼣?shù)次,最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?br/>3、用滴管吸乙醇,將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直到濾紙上沒有綠色和殘留物為止。最后,用乙醇稀釋至100mL,搖勻。
4、取葉綠體色素提取物分別在665nm、645nm和652nm波長處測定吸光度,以95%乙醇為空白對照。
防范措施
1、光照對葉綠素有破壞作用。實(shí)驗(yàn)應(yīng)在弱光下進(jìn)行,研磨時(shí)間盡量短。
2、如果色素提取液中混有其他物質(zhì)引起混濁,會(huì)影響吸光度的測定,應(yīng)重新過濾或離心。
3、測量色素的吸光度前,應(yīng)根據(jù)儀器說明書和標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a、b校準(zhǔn)分光光度計(jì)的波長,否則會(huì)影響葉綠素含量的測量精度。
常見問題
1、無水乙醇提取時(shí)間較長,對某些物質(zhì)尤其是木本植物的葉綠素提取不夠完全。無水丙酮萃取會(huì)出現(xiàn)渾濁,影響比色測定。因此,提取葉綠素最好選擇丙酮和無水乙醇,比例為2:1效果更佳。
2、傳統(tǒng)的80%丙酮法由于含水量高,提取速度慢,測定值低,葉綠素穩(wěn)定性差,應(yīng)慎用。原則葉綠素廣泛存在于水果、蔬菜等綠色植物組織中,在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合形成葉綠體。植物細(xì)胞死亡時(shí),葉綠素是游離的,游離的葉綠素很不穩(wěn)定,對光熱敏感;在酸性條件下,葉綠素產(chǎn)生綠褐色的脫鎂葉綠素,脫鎂葉綠素在稀酸堿液中水解成亮綠色的葉綠素以及葉綠醇和甲醇。高等植物中的葉綠素有兩種:葉綠素a和b,均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。


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